· поліакрыламідГель павінен быць атрыманы шляхам акрыламіднага мономера, зыходнага матэрыялу для палімерызацыі, каталізатара і сумесі солі і буфера.
· акрыламіда BIS (N, N'-метыленавы двайны акрыламід) — гэта манамерная гелевая матрыца.
· персульфат амонію запускае працэс палімерызацыі клею. Для падрыхтоўкі клею патрабуецца 10% раствор персульфату амонію, прыгатаваны ў вадзе. Большая частка інфармацыі паказвала на неабходнасць актыўнага выкарыстання. Аднак 10% раствор можна захоўваць пры тэмпературы 4℃ на працягу некалькіх тыдняў без значнай страты актыўнасці. Давесці да 10 мл і выкінуць, калі клей перастане агрэгаваць.
Парада: працэнтакрыламідУ секвенаванні клей і бялковы клей — гэта не адно і тое ж. Пры выкарыстанні гатовага раствора акрыламіду:BIS пераканайцеся, што вы атрымалі патрэбную бутэльку.
· ТЭМЕД (N, N, N ', N '- тэтраметылэтылендыамін) — каталізатар, у карычневай бутэльцы, якая змяшчаецца ў халадзільнік. Дадаецца непасрэдна перад заліваннем клею.
· поліакрыламідны электрафарэз: шкло, якое выкарыстоўваецца ў электрафарэзе, трэба мыць да і пасля кожнага разу. Пасля электрафарэзу памыць мяккай шчоткай і тканінай у гарачай вадзе з мылам, прамыць дыстыляванай вадой і даць высахнуць.
· вільгаць і пыл могуць выклікаць уздзеянне полых палімераў. Перад электрафарэзам ачысціце шкляную пласціну ачышчальнікам для шкла і працярыце яе мяккай шчоткай. Памыйце дыстыляванай вадой і старанна высушыце папяровай сурвэткай. Прамыйце 70% этанолам перад праціраннем паперай, каб ачысціць і паскорыць высыханне. Дадайце ўзоры акрыламіду паслядоўна: BIS, ваду, буферны раствор, персульфат амонію, TEMED. Добра страсяніце і адразу выліце.
Няма неабходнасці дэгазаваць поліакрыламід перад палімерызацыяй. (Раней акрыламід змяшчалі ў вакуум для выдалення бурбалак, бо кісларод перашкаджае палімерызацыі.)
Узоры наканечнікаў для гарызантальных клеевых кропак.
· Пакладзеце ў ніжнюю скрынку кавалак чорнай паперы на чорным фоне, каб зрабіць адтуліну для ўзору і было бачна лепш.
· буфер, запоўнены клеевым бакам, крыху вышэй за калоід.
· калі на краі ёсць падсветка, уключыце яе, дайце святлу ззяць калоідным святлом. Набярыце ўзор у піпетку.
· з выкарыстаннем аўтаматычнай піпеткі.
· пры 10-200 мкм у большасці кропак узору можна выкарыстоўваць 1 кропку для рухомай вадкасці. Для вельмі малых адтулін узору (менш за 10 мкм) зручней выкарыстоўваць доўгае піпеткавае прыстасаванне для секвенавання клею.
· піпетаванне, толькі што пагружанае ва ўзор, удыханне павольна рухомай вадкасці. Узор можа выглядаць ліпкім ад гліцэрыну, і хуткае перапампоўванне можа прыцягнуць бурбалкі паветра ў галоўку піпеткі.
· Пасля ўдыху піпетачнай галоўкай акуратна перамяшчайце галоўку вадкасці па краі трубкі або выцірайце паперай, каб высмоктаць галоўку вадкасці за межы кропель. Будзьце асцярожныя, каб не высмоктваць узор.
Змесціце ўзор у адтуліну для ўзору
· піпетуючая прылада для падтрымання невялікага ціску, злёгку перамяшчае галоўку пераліўной вадкасці ўзораў.
· Піпетачная галоўка, устаўленая ў буфер, крыху вышэй за кропкавыя адтуліны, падтрымлівае станоўчы ціск. Канчык піпеткі можна ўставіць у невялікую адтуліну.
· павольна і стабільна выміце ўзоры. Канчык піпеткі размяшчаецца над адтулінай для ўзору, і ўзор апусціцца ў адтуліну. Дайце ўзору апусціцца, каб запоўніць адтуліну, замест таго, каб праціскаць яе.
· як толькі апошняя кропля ўзору збярэцца з вадкай галоўкай, вадкасць пяройдзе да другой ножкі, павольна падніміце рух вадкасці і выйдзе з буфера
Як зрабіць вертыкальны адбор проб клею?
· вертыкальныя клеевыя кропкі, якія ўтварыліся паміж двума кавалкамі шкла. У вельмі разрэджаным клеі галоўку піпеткі нават нельга ўставіць паміж дзвюма шклянымі пласцінамі. Сачыце за гліцэрынам! Надзеньце галоўку піпеткі на адтуліну для ўзору, і ўзор апусціцца ў адтуліну.
· Перад адборам пробы абавязкова прамыйце адтуліну для ўзору з вертыкальнай кропкі поліпрапілен-ацылавага геля. Змыйце непалімерызаваны акрыламід і ваду, якая можа з'явіцца на дне адтуліны для ўзору. Вада можа значна паменшыць адтуліну для ўзору. Выкарыстоўвайце шпрыц аб'ёмам 25 мл або 50 мл і іголку 18 калібра. Наліце буфер для электрафарэзу і старанна прамыйце адтуліну для ўзору.
· Адтуліну для ўзору можа быць цяжка ўбачыць, але ў астатнім усё лёгка. Калі ёсць лішнія адтуліны, буфер для ўзору можна праверыць бромфенолавым сінім.
Час публікацыі: 31 сакавіка 2023 г.